Kryteria walidacji testu BMP wg Holliger i in. (2016) i ich rozwinięcia

Publikacja Holliger i in. (2016) jest podsumowaniem pracy międzynarodowej grupy badaczy nad ujednoliceniem testów BMP. Definiuje ona obowiązkowe elementy walidacji: minimalną liczbę powtórzeń, próbę ślepą i kontrolę dodatnią (celulozę), kryterium czasu trwania testu, sposób obliczania BMP oraz kryteria odrzucenia testu; ponadto zaleca m.in. I/S co najmniej 2 na bazie VS i pełne raportowanie warunków. Liczbowe kryteria walidacji zostały następnie doprecyzowane na podstawie dwóch międzynarodowych badań międzylaboratoryjnych (Hafner i in. 2020) i włączone do zaktualizowanych wytycznych (Holliger i in. 2021) — ten aktualny stan opisujemy poniżej. Nie jest to akt prawny, lecz punkt odniesienia dla laboratoriów i klientów.

Zakres zaleceń

Wyniki spełniające wszystkie kryteria można określić jako „zwalidowane”; w przeciwnym razie test należy powtórzyć. Aktualne, otwarcie dostępne wersje dokumentów (m.in. dokument 100 „Requirements for measurement and validation of BMP”) prowadzi grupa autorów na stronie DBFZ (dbfz.de/en/BMP).

Kryterium zakończenia

Test kończy się, gdy produkcja dobowa metanu z pojedynczej butelki przez trzy kolejne doby jest niższa niż 1,0% skumulowanego przyrostu netto metanu z substratu (próba z substratem minus średnia ze ślepych). Przy pomiarach wykonywanych rzadziej niż codziennie test można zakończyć po pierwszym odstępie między pomiarami (łącznie co najmniej 3 doby), w którym tempo spadło poniżej tego progu. W praktyce dla większości substratów oznacza to od kilkunastu do kilkudziesięciu dni, dla lignocelulozowych dłużej. Niektóre laboratoria przyjmują stały czas, np. 28 lub 30 dni, jednak taki wybór może zaniżać wynik dla powoli rozkładalnych materiałów. W raporcie podaje się faktyczny czas i końcowe tempo produkcji.

Powtarzalność i odrzucanie wyników

Odchylenie powtórzeń jest podstawowym wskaźnikiem jakości; dla celulozy aktualne kryterium to RSD nie większe niż 6%. Jeśli jedna butelka wyraźnie odstaje (nieszczelność, błąd naważki), można ją odrzucić, ale tylko z udokumentowaną przyczyną. Dowolne usuwanie „niewygodnych” wyników zniekształca niepewność. Przy małej liczbie powtórzeń niepewność jest słabo oszacowana.

Raportowanie

Poprawny raport zawiera:

1. Opis substratu: pochodzenie, przygotowanie, TS, VS.
2. Inokulum: źródło, TS, VS, pH, odgazowanie.
3. I/S i naważki.
4. Temperatura, czas, metoda pomiaru gazu i wzory.
5. Wyniki prób ślepych i kontroli celulozowej.
6. Wyniki substratu: średnia, odchylenie, liczba powtórzeń, krzywe skumulowane.
7. Informację o odstępstwach od protokołu.

Od 2016 do 2021: doprecyzowanie kryteriów

Po warsztatach w Leysin (czerwiec 2015) i publikacji wytycznych w 2016 r. przeprowadzono dwa międzynarodowe badania międzylaboratoryjne, a w 2018 r. odbył się kolejny warsztat (Freising). Hafner i in. (2020) przeanalizowali ponad 400 wartości BMP z ponad trzydziestu laboratoriów z czternastu krajów. Względne odchylenie standardowe między laboratoriami wynosiło 7,5–24%, a po zastosowaniu kryteriów walidacji spadało poniżej 8% dla wszystkich czterech badanych substratów. Rekomendowane kryteria walidacji to: czas trwania testu (co najmniej 1% przyrostu netto na 3 doby), RSD celulozy nie większe niż 6% oraz średni BMP celulozy w przedziale 340–395 NmL CH₄/g VS. Autorzy wskazali, że kryterium dla celulozy okazało się szczególnie ważne. Zaktualizowane wytyczne przedstawiono w komentarzu Holliger i in. (2021, online 2020) i prowadzi się je jako otwarty dokument „Requirements for measurement and validation of BMP”.

Osobną kwestią jest sposób obliczania produkcji metanu z pomiarów (gaz suchy, warunki normalne, objętość przestrzeni gazowej) — opisują go dokumenty z serii 200 tego samego zbioru metod; w pracy Hafnera i in. (2020) wskazano, że błędy w przetwarzaniu i wprowadzaniu danych należały do istotnych źródeł rozrzutu.

Przykład użycia kryteriów przez zleceniodawcę

Zlecasz test kiszonki i otrzymujesz wynik 340 NmL/g VS. Sprawdź w raporcie: czy podano I/S (zalecane ≥ 2), czy średni BMP celulozy mieści się w przedziale 340–395 NmL/g VS z RSD ≤ 6%, liczbę powtórzeń (co najmniej 3) i kryterium zakończenia. Brak któregokolwiek elementu nie unieważnia wyniku automatycznie, ale zmniejsza jego użyteczność — poproś o uzupełnienie.

Ograniczenia

• Zalecenia dotyczą okresowych (wsadowych) testów BMP; nie obejmują testów ciągłych.
• Niektóre substraty (tłuszcze, materiały silnie inhibitujące) wymagają modyfikacji protokołu.
• Zgodność z wytycznymi nie eliminuje rozrzutu wynikającego z niejednorodności próbki.

Wskazówki dla laboratoriów

1. Wprowadź wewnętrzną procedurę opartą na aktualnych wytycznych.
2. Uczestnicz w badaniach międzylaboratoryjnych, jeśli są dostępne.
3. Archiwizuj karty kontrolne wyników celulozy.
4. Aktualizuj procedury po lekturze nowszych prac.

Jak wykorzystać wytyczne w umowie z laboratorium

Zamawiając badania BMP, wpisz w zlecenie: protokół (np. zgodny z zaleceniami Holliger i in. 2016 w wersji zaktualizowanej 2021), minimalną liczbę powtórzeń, wymagany I/S, kryterium zakończenia, wymóg kontroli celulozowej oraz format raportu z danymi surowymi. Pozwala to później porównywać wyniki z różnych serii i laboratoriów oraz uniknąć sporów o interpretację.

Co zmieniło się po 2016 roku

Rośnie liczba badań międzylaboratoryjnych i prac nad obliczeniami, a także nad testami z automatycznymi systemami pomiarowymi. Wytyczne z 2016 r. pozostają jednak najczęściej przywoływanym punktem odniesienia. Zalecenia są aktualizowane na podstawie nowych badań międzylaboratoryjnych, dlatego warto sprawdzać aktualną wersję dokumentów i opisywać w raportach, według której wersji wykonano test.

Przykład listy kontrolnej odbioru raportu

• [ ] Wskazano wytyczne, według których wykonano test.
• [ ] Podano liczbę powtórzeń i odchylenie.
• [ ] Przedstawiono wynik celulozy i próby ślepej.
• [ ] Podano I/S i temperaturę.
• [ ] Wyjaśniono kryterium końca i czas trwania.
• [ ] Wskazano warunki odniesienia objętości gazu.
• [ ] Załączono krzywe skumulowane.